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crRNA和tracrRNA是怎么融合成一条sgRNA的呢?
此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（singleguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。
CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA ，从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
这个识别复合体可以通过融合 crRNA 与 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约 20bp 的片段与 crRNA 或 sgRNA 互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域 PAM（5『-NGG-3』）为 Cas9 识别位点，是实现剪切功能的关键。图 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑。
single。有两种方法：1，体外转录sgRNA+ tracrRNA，然后跟cas9蛋白同转化细菌；2，是构建适合你得菌的敲除质粒，主要是启动子这块需要考虑，但是质粒进去了你得考虑到质。如果是要体外合成grna 一般都是找外包做吧 如果已有寡核苷酸 那就直接放入cas表达载体即可，可用Thermo公司的。
此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。
CRISPR RNA （crRNA） array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到定位+编辑的功能 gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。所以，人们就把crRNA和tracrRNA合在一起，成为了single-guide RNA，即sgRNA，而通过修改tracrRNA的序列，在理论上可以on-target任何目的靶点。
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